Javascript bħalissa huwa diżattivat fil-browser tiegħek.Meta javascript ikun diżattivat, xi funzjonijiet ta' din il-websajt ma jaħdmux.
Javier Fidalgo, * Pierre-Antoine Deglesne, * Rodrigo Arroyo, * Lilian Sepúlveda, * Evgeniya Ranneva, Philippe Deprez Dipartiment tax-Xjenza, Skin Tech Pharma Group, Castello D'Empúries, Katalunja, Spanja * Dawn l-awturi għandhom xi għarfien dwar dan ix-xogħol Equal sfond tal-kontribuzzjoni: L-aċidu hyaluronic (HA) huwa polysaccharide li jseħħ b'mod naturali użat fil-produzzjoni ta 'fillers dermali għal skopijiet estetiċi.Peress li għandu half-life ta 'diversi jiem fit-tessuti umani, il-mili dermali bbażati fuq HA huma modifikati kimikament biex jestendu l-ħajja tagħhom fil-ġisem.L-aktar modifika komuni fil-mili kummerċjali bbażati fuq HA hija l-użu ta '1,4-butanediol diglycidyl ether (BDDE) bħala aġent ta' crosslinking biex inkroċjat il-ktajjen HA.BDDE residwu jew mhux reazzjoni huwa meqjus bħala mhux tossiku f'<2 partijiet għal kull miljun (ppm);għalhekk, il-BDDE residwu fil-mili tal-ġilda finali għandu jiġi kkwantifikat biex tiġi żgurata s-sigurtà tal-pazjent.Materjali u metodi: Dan l-istudju jiddeskrivi l-iskoperta u l-karatterizzazzjoni ta 'prodott sekondarju tar-reazzjoni ta' cross-linking bejn BDDE u HA taħt kundizzjonijiet alkalini billi tikkombina kromatografija likwida u spettrometrija tal-massa (LC-MS).Riżultati: Wara analiżi differenti, instab li l-kundizzjonijiet alkalini u t-temperatura għolja użati għad-diżinfettazzjoni tal-idroġel HA-BDDE ippromwovew il-formazzjoni ta 'dan il-prodott sekondarju ġdid, il-kompost "bħal propylene glycol".L-analiżi LC-MS ikkonfermat li l-prodott sekondarju għandu l-istess massa monoisotopika bħal BDDE, ħin ta 'ritenzjoni differenti (tR), u modalità ta' assorbiment UV differenti (λ=200 nm).B'differenza mill-BDDE, kien osservat fl-analiżi LC-MS li taħt l-istess kundizzjonijiet ta 'kejl, dan il-prodott sekondarju għandu rata ta' skoperta ogħla f'200 nm.Konklużjoni: Dawn ir-riżultati jindikaw li m'hemm l-ebda epossidu fl-istruttura ta 'dan il-kompost ġdid.Id-diskussjoni hija miftuħa biex jiġi vvalutat ir-riskju ta 'dan il-prodott sekondarju ġdid misjub fil-produzzjoni ta' idroġel HA-BDDE (mili dermali HA) għal skopijiet kummerċjali.Kliem ewlieni: aċidu hyaluronic, mili dermali HA, aċidu hyaluronic cross-linked, BDDE, analiżi LC-MS, prodott sekondarju BDDE.
Fillers ibbażati fuq aċidu hyaluronic (HA) huma l-aktar fillers dermali komuni u popolari użati għal skopijiet kosmetiċi.1 Dan il-mili dermali huwa idroġel, ġeneralment magħmul minn> 95% ilma u 0.5-3% HA, li jagħtihom struttura bħal ġel.2 HA huwa polysaccharide u l-komponent ewlieni tal-matriċi extraċellulari tal-vertebrati.Wieħed mill-ingredjenti.Tikkonsisti f'unitajiet ta 'disaccharide (1,4)-glukuronic acid-β (1,3)-N-acetylglucosamine (GlcNAc) konnessi b'rabtiet glycosidic.Dan il-mudell tad-disaccharide huwa l-istess fl-organiżmi kollha.Meta mqabbel ma 'xi fillers ibbażati fuq il-proteini (bħal kollaġen), din il-proprjetà tagħmel HA molekula bijokompatibbli ħafna.Dawn il-fillers jistgħu juru speċifiċità ta' sekwenza ta' aċidi amminiċi li tista' tiġi rikonoxxuta mis-sistema immuni tal-pazjent.
Meta jintuża bħala mili dermali, il-limitazzjoni ewlenija ta 'HA hija d-dħul rapidu tagħha fit-tessuti minħabba l-preżenza ta' familja speċifika ta 'enzimi msejħa hyaluronidases.S'issa, ġew deskritti diversi modifiki kimiċi fl-istruttura tal-HA biex iżidu l-half-life tal-HA fit-tessuti.3 Ħafna minn dawn il-modifiki jippruvaw inaqqsu l-aċċess ta 'hyaluronidase għal polimeri tal-polisakkaridi billi jgħaqqdu l-ktajjen HA.Għalhekk, minħabba l-formazzjoni ta 'pontijiet u r-rabtiet kovalenti intermolekulari bejn l-istruttura HA u l-aġent ta' cross-linking, l-idroġel HA cross-linked jipproduċi aktar prodotti ta 'degradazzjoni kontra l-enzimi mill-HA naturali.4-6
S'issa, l-aġenti ta 'crosslinking kimiċi użati biex jipproduċu HA crosslinked jinkludu metacrilamide, 7 hydrazide, 8 carbodiimide, 9 divinyl sulfone, 1,4-butanediol diglycidyl ether (BDDE) U poly(ethylene glycol) diglycidyl ether.10,11 BDDE bħalissa huwa l-aktar aġent ta' crosslinking użat b'mod komuni.Għalkemm dawn it-tipi ta 'hydrogels ġew ippruvati li huma sikuri għal għexieren ta' snin, l-aġenti crosslinking użati huma reaġenti reattivi li jistgħu jkunu ċitotossiċi u, f'xi każijiet, mutaġeniċi.12 Għalhekk, il-kontenut residwu tagħhom fl-idroġel finali għandu jkun għoli.BDDE huwa kkunsidrat sigur meta l-konċentrazzjoni residwa hija inqas minn 2 partijiet għal kull miljun (ppm).4
Hemm diversi metodi biex tiskopri konċentrazzjoni ta' BDDE b'residwu baxx, grad ta' cross-linking u pożizzjoni ta' sostituzzjoni f'idrogels HA, bħal kromatografija tal-gass, kromatografija ta' esklużjoni tad-daqs flimkien ma 'spettrometrija tal-massa (MS), metodi ta' kejl ta 'fluworexxenza ta' reżonanza manjetika nukleari (NMR), u Array tad-diode akkoppjat kromatografija likwida ta 'prestazzjoni għolja (HPLC).13-17 Dan l-istudju jiddeskrivi l-iskoperta u l-karatterizzazzjoni ta 'prodott sekondarju fl-idroġel HA cross-linked finali prodott mir-reazzjoni ta' BDDE u HA taħt kundizzjonijiet alkalini.HPLC u kromatografija likwida-spettrometrija tal-massa (analiżi LC-MS).Peress li t-tossiċità ta 'dan il-prodott sekondarju tal-BDDE mhix magħrufa, nirrakkomandaw li l-kwantifikazzjoni tar-residwi tagħha għandha tiġi determinata b'mod simili għall-metodu li normalment isir fuq BDDE fil-prodott finali.
Il-melħ tas-sodju miksub ta 'HA (Shiseido Co., Ltd., Tokyo, Ġappun) għandu piż molekulari ta' ~ 1,368,000 Da (metodu Laurent) 18 u viskożità intrinsika ta '2.20 m3/kg.Għar-reazzjoni ta 'crosslinking, BDDE (≥95%) inxtara minn Sigma-Aldrich Co. (St. Louis, MO, USA).Salina buffered fosfat b'pH 7.4 inxtara minn Sigma-Aldrich Company.Is-solventi, l-acetonitrile u l-ilma kollha użati fl-analiżi LC-MS inxtraw minn kwalità ta 'grad HPLC.L-aċidu formiku (98%) jinxtara bħala grad ta 'reaġent.
L-esperimenti kollha twettqu fuq sistema UPLC Acquity (Waters, Milford, MA, USA) u konnessi ma 'spettrometru tal-massa quadrupole triple API 3000 mgħammar b'sors ta' jonizzazzjoni elettrospray (AB SCIEX, Framingham, MA, USA).
Is-sinteżi ta 'idroġels HA cross-linked inbdiet billi żżid 198 mg ta' BDDE għal soluzzjoni ta '10% (w/w) sodium hyaluronate (NaHA) fil-preżenza ta' 1% alkali (idrossidu tas-sodju, NaOH).Il-konċentrazzjoni finali ta 'BDDE fit-taħlita ta' reazzjoni kienet 9.9 mg/mL (0.049 mM).Imbagħad, it-taħlita ta 'reazzjoni ġiet imħallata sewwa u omoġenizzata u titħalla tipproċedi f'45 ° C għal 4 sigħat.19 Il-pH tar-reazzjoni jinżamm f'~12.
Wara, it-taħlita ta 'reazzjoni ġiet maħsula bl-ilma, u l-idroġel finali HA-BDDE ġie ffiltrat u dilwit b'buffer PBS biex tinkiseb konċentrazzjoni HA ta' 10 sa 25 mg/mL, u pH finali ta '7.4.Sabiex jiġu sterilizzati l-idroġels HA cross-linked prodotti, dawn l-idroġels kollha huma awtoklavati (120 ° C għal 20 minuta).L-idroġel purifikat BDDE-HA jinħażen f'4°C sal-analiżi.
Biex tanalizza l-BDDE preżenti fil-prodott HA cross-linked, kampjun ta' 240 mg ġie miżun u introdott fit-toqba taċ-ċentru (Microcon®; Merck Millipore, Billerica, MA, USA; volum 0.5 mL) u ċentrifugat f'10,000 rpm f'temperatura tal-kamra. 10 minuta.Ġie miġbur u analizzat total ta' 20 µL ta' likwidu pull-down.
Sabiex jiġi analizzat l-istandard BDDE (Sigma-Aldrich Co) taħt kundizzjonijiet alkalini (1%, 0.1% u 0.01% NaOH), jekk jiġu sodisfatti l-kundizzjonijiet li ġejjin, il-kampjun likwidu huwa 1:10, 1:100, jew sa 1:1,000,000 Jekk meħtieġ, uża ilma dejonizzat MilliQ għall-analiżi.
Għall-materjali tal-bidu użati fir-reazzjoni ta 'cross-linking (HA 2%, H2O, 1% NaOH, u 0.049 mM BDDE), 1 mL ta' kull kampjun ippreparat minn dawn il-materjali ġie analizzat bl-użu tal-istess kundizzjonijiet ta 'analiżi.
Biex tiddetermina l-ispeċifiċità tal-qċaċet li jidhru fil-mappa tal-jone, 10 µL ta’ 100 ppb soluzzjoni standard BDDE (Sigma-Aldrich Co) ġew miżjuda mal-kampjun ta’ 20 µL.F'dan il-każ, il-konċentrazzjoni finali tal-istandard f'kull kampjun hija 37 ppb.
L-ewwel, ipprepara soluzzjoni stokk BDDE b'konċentrazzjoni ta '11,000 mg/L (11,000 ppm) billi tħallat 10 μL ta' BDDE standard (Sigma-Aldrich Co) b'990 μL ilma MilliQ (densità 1.1 g/mL).Uża din is-soluzzjoni biex tipprepara soluzzjoni BDDE ta' 110 µg/L (110 ppb) bħala dilwizzjoni standard intermedja.Imbagħad, uża d-dilwent standard intermedju BDDE (110 ppb) biex tħejji l-kurva standard billi tħallat id-dilwent intermedju diversi drabi biex tikseb il-konċentrazzjoni mixtieqa ta '75, 50, 25, 10, u 1 ppb.Kif muri fil-Figura 1, jinstab li l-kurva standard BDDE minn 1.1 sa 110 ppb għandha linearità tajba (R2> 0.99).Il-kurva standard ġiet ripetuta f'erba 'esperimenti indipendenti.
Figura 1 Kurva ta 'kalibrazzjoni standard BDDE miksuba permezz ta' analiżi LC-MS, li fiha hija osservata korrelazzjoni tajba (R2> 0.99).
Abbrevjazzjonijiet: BDDE, 1,4-butanediol diglycidyl ether;LC-MS, kromatografija likwida u spettrometrija tal-massa.
Sabiex jiġu identifikati u kwantifikati l-istandards BDDE preżenti fl-HA cross-linked u l-istandards BDDE fis-soluzzjoni bażi, intużat analiżi LC-MS.
Is-separazzjoni kromatografika nkisbet fuq kolonna LUNA 2.5 µm C18(2)-HST (50×2.0 mm2; Phenomenex, Torrance, CA, USA) u miżmuma f'temperatura ambjentali (25°C) matul l-analiżi.Il-fażi mobbli tikkonsisti f'acetonitrile (solvent A) u ilma (solvent B) li fihom 0.1% aċidu formiku.Il-fażi mobbli hija eluduta b'eluzzjoni gradjent.Il-gradjent huwa kif ġej: 0 minuti, 2% A;1 minuta, 2% A;6 minuti, 98% A;7 minuti, 98% A;7.1 minuti, 2% A;10 minuti, 2% A. Il-ħin tat-tħaddim huwa 10 minuti u l-volum tal-injezzjoni huwa 20 µL.Il-ħin ta 'żamma ta' BDDE huwa ta 'madwar 3.48 minuti (li jvarjaw minn 3.43 sa 4.14 minuti bbażati fuq esperimenti).Il-fażi mobbli ġiet ippumpjata b'rata ta 'fluss ta' 0.25 mL/min għall-analiżi LC-MS.
Għall-analiżi BDDE u l-kwantifikazzjoni mill-MS, is-sistema UPLC (Waters) hija kkombinata ma 'spettrometru tal-massa quadrupole triple API 3000 (AB SCIEX) mgħammar b'sors ta' jonizzazzjoni elettrospray, u l-analiżi titwettaq f'modalità ta 'jone pożittiv (ESI+).
Skont l-analiżi tal-framment tal-jone mwettqa fuq BDDE, il-framment bl-ogħla intensità ġie determinat li jkun il-framment li jikkorrispondi għal 129.1 Da (Figura 6).Għalhekk, fil-mod ta 'monitoraġġ multi-jone (MIM) għall-kwantifikazzjoni, il-konverżjoni tal-massa (proporzjon tal-massa għal ċarġ [m/z]) ta' BDDE hija 203.3/129.1 Da.Juża wkoll modalità ta 'skan sħiħ (FS) u mod ta' skanjar tal-jone tal-prodott (PIS) għall-analiżi LC-MS.
Sabiex tiġi vverifikata l-ispeċifiċità tal-metodu, ġie analizzat kampjun vojt (fażi mobbli inizjali).L-ebda sinjal ma ġie skopert fil-kampjun vojt b'konverżjoni tal-massa ta '203.3/129.1 Da.Rigward ir-ripetibbiltà tal-esperiment, ġew analizzati 10 injezzjonijiet standard ta '55 ppb (f'nofs il-kurva tal-kalibrazzjoni), li rriżultaw f'devjazzjoni standard residwa (RSD) <5% (dejta mhux murija).
Il-kontenut residwu ta 'BDDE ġie kkwantifikat fi tmien idroġels HA cross-linked BDDE awtoklavati differenti, li jikkorrispondu għal erba' esperimenti indipendenti.Kif deskritt fit-taqsima "Materjali u Metodi", il-kwantifikazzjoni hija evalwata bil-valur medju tal-kurva tar-rigressjoni tad-dilwizzjoni standard BDDE, li tikkorrispondi mal-quċċata unika misjuba fit-tranżizzjoni tal-massa BDDE ta '203.3/129.1 Da, b'ritenzjoni ħin ta' 3.43 sa 4.14 minuti Mhux qed tistenna.Il-Figura 2 turi kromatogramma eżempju tal-istandard ta' referenza BDDE ta' 10 ppb.Tabella 1 tiġbor fil-qosor il-kontenut residwu ta 'BDDE ta' tmien idroġels differenti.Il-firxa tal-valur hija minn 1 sa 2.46 ppb.Għalhekk, il-konċentrazzjoni residwa tal-BDDE fil-kampjun hija aċċettabbli għall-użu mill-bniedem (<2 ppm).
Figura 2 Kromatogramma tal-joni ta '10 ppb standard ta' referenza BDDE (Sigma-Aldrich Co), transizzjoni MS (m/z) miksuba permezz ta 'analiżi LC-MS ta' 203.30/129.10 Da (f'mod MRM pożittiv).
Abbrevjazzjonijiet: BDDE, 1,4-butanediol diglycidyl ether;LC-MS, kromatografija likwida u spettrometrija tal-massa;MRM, monitoraġġ ta' reazzjoni multipla;MS, massa;m/z, proporzjon tal-massa għall-ħlas.
Nota: Il-kampjuni 1-8 huma idroġels HA BDDE inkroċjati awtoklavati.L-ammont residwu ta 'BDDE fl-idroġel u l-quċċata tal-ħin ta' żamma ta 'BDDE huma rrappurtati wkoll.Fl-aħħar nett, hija rrappurtata wkoll l-eżistenza ta' quċċata ġodda b'ħinijiet ta' żamma differenti.
Abbrevjazzjonijiet: BDDE, 1,4-butanediol diglycidyl ether;HA, aċidu hyaluronic;MRM, monitoraġġ ta' reazzjoni multipla;tR, ħin ta' żamma;LC-MS, kromatografija likwida u spettrometrija tal-massa;RRT, ħin ta' żamma relattiv.
B'mod sorprendenti, l-analiżi tal-kromatogramma tal-jone LC-MS wriet li bbażat fuq il-kampjuni kollha tal-idroġel HA inkroċjati awtoklavati analizzati, kien hemm quċċata żejda fil-ħin ta 'żamma iqsar ta' 2.73 sa 3.29 minuti.Pereżempju, il-Figura 3 turi l-kromatogramma tal-jone ta 'kampjun HA cross-linked, fejn quċċata addizzjonali tidher f'ħin ta' żamma differenti ta 'madwar 2.71 minuti.Il-ħin ta 'ritenzjoni relattiv osservat (RRT) bejn il-quċċata osservata ġdida u l-quċċata minn BDDE instab li kien 0.79 (Tabella 1).Peress li nafu li l-quċċata osservata l-ġdida hija inqas miżmuma fil-kolonna C18 użata fl-analiżi LC-MS, il-quċċata l-ġdida tista 'tikkorrispondi għal kompost aktar polari minn BDDE.
Figura 3 Ion chromatogram ta 'cross-linked HA hydrogel kampjun miksub permezz ta' LC-MS (konverżjoni tal-massa MRM 203.3/129.0 Da).
Abbrevjazzjonijiet: HA, aċidu hyaluronic;LC-MS, kromatografija likwida u spettrometrija tal-massa;MRM, monitoraġġ ta' reazzjoni multipla;RRT, ħin ta' żamma relattiv;tR, ħin ta' żamma.
Sabiex tiġi eskluża l-possibbiltà li l-quċċati l-ġodda osservati jistgħu jkunu kontaminanti oriġinarjament preżenti fil-materja prima użata, dawn il-materja prima ġew analizzati wkoll bl-użu tal-istess metodu ta 'analiżi LC-MS.Il-materjali tal-bidu analizzati jinkludu ilma, 2% NaHA fl-ilma, 1% NaOH fl-ilma, u BDDE fl-istess konċentrazzjoni użata fir-reazzjoni ta 'cross-linking.Il-kromatogramma tal-jone tal-materjal tal-bidu użat ma wriet l-ebda kompost jew quċċata, u l-ħin ta 'żamma tiegħu jikkorrispondi għall-quċċata l-ġdida osservata.Dan il-fatt jarmi l-idea li mhux biss il-materjal tal-bidu jista 'jkun fih xi komposti jew sustanza li jistgħu jinterferixxu mal-proċedura ta' analiżi, iżda m'hemm l-ebda sinjal ta 'kontaminazzjoni inkroċjata possibbli ma' prodotti oħra tal-laboratorju.Il-valuri ta 'konċentrazzjoni miksuba wara analiżi LC-MS ta' BDDE u qċaċet ġodda huma murija fit-Tabella 2 (kampjuni 1-4) u l-kromatogramma tal-jone fil-Figura 4.
Nota: Il-kampjuni 1-4 jikkorrispondu għall-materja prima użata biex tipproduċi idroġels HA BDDE inkroċjati awtoklavati.Dawn il-kampjuni ma kinux awtoklavi.
Abbrevjazzjonijiet: BDDE, 1,4-butanediol diglycidyl ether;HA, aċidu hyaluronic;LC-MS, kromatografija likwida u spettrometrija tal-massa;MRM, monitoraġġ ta' reazzjoni multipla.
Il-Figura 4 tikkorrispondi għall-kromatogramma LC-MS ta 'kampjun tal-materja prima użata fir-reazzjoni ta' cross-linking ta 'HA u BDDE.
Nota: Dawn kollha huma mkejla fl-istess konċentrazzjoni u proporzjon użat biex titwettaq ir-reazzjoni ta 'cross-linking.In-numri għall-materja prima analizzati mill-kromatogramma jikkorrispondu għal: (1) ilma, (2) 2% soluzzjoni milwiema HA, (3) soluzzjoni akwea 1% NaOH.L-analiżi LC-MS titwettaq għal konverżjoni tal-massa ta '203.30/129.10 Da (f'mod MRM pożittiv).
Abbrevjazzjonijiet: BDDE, 1,4-butanediol diglycidyl ether;HA, aċidu hyaluronic;LC-MS, kromatografija likwida u spettrometrija tal-massa;MRM, monitoraġġ ta' reazzjoni multipla.
Ġew studjati l-kundizzjonijiet li wasslu għall-formazzjoni ta 'qċaċet ġodda.Sabiex jiġi studjat kif il-kundizzjonijiet ta 'reazzjoni użati biex jipproduċu l-idroġel HA inkroċjat jaffettwaw ir-reattività tal-aġent ta' cross-linking BDDE, li jwasslu għall-formazzjoni ta 'qċaċet ġodda (prodotti sekondarji possibbli), twettqu kejl differenti.F'dawn id-determinazzjonijiet, studjajna u analizzajna l-crosslinker finali BDDE, li ġie ttrattat b'konċentrazzjonijiet differenti ta 'NaOH (0%, 1%, 0.1%, u 0.01%) f'medja milwiema, segwit minn jew mingħajr awtoklavi.Il-proċedura tal-batterja biex tissimula l-istess kundizzjonijiet hija l-istess bħall-metodu użat biex jipproduċi l-idroġel HA cross-linked.Kif deskritt fit-taqsima "Materjali u Metodi", it-tranżizzjoni tal-massa tal-kampjun ġiet analizzata minn LC-MS għal 203.30/129.10 Da.Il-BDDE u l-konċentrazzjoni tal-quċċata l-ġdida huma kkalkulati, u r-riżultati huma murija fit-Tabella 3. L-ebda quċċata ġdida ma nstabet fil-kampjuni li ma kinux awtoklavi, irrispettivament mill-preżenza ta 'NaOH fis-soluzzjoni (kampjuni 1-4, Tabella 3).Għal kampjuni awtoklavi, qċaċet ġodda jinstabu biss fil-preżenza ta 'NaOH fis-soluzzjoni, u l-formazzjoni tal-quċċata tidher li tiddependi fuq il-konċentrazzjoni ta' NaOH fis-soluzzjoni (kampjuni 5-8, Tabella 3) (RRT = 0.79).Il-Figura 5 turi eżempju ta' kromatogramma tal-joni, li turi żewġ kampjuni awtoklavi fil-preżenza jew in-nuqqas ta' NAOH.
Abbrevjazzjonijiet: BDDE, 1,4-butanediol diglycidyl ether;LC-MS, kromatografija likwida u spettrometrija tal-massa;MRM, monitoraġġ ta' reazzjoni multipla.
Nota: Il-kromatogramma ta 'fuq: Il-kampjun ġie ttrattat b'soluzzjoni akwea ta' 0.1% NaOH u awtoklavat (120 ° C għal 20 minuta).Kromatogramma tal-qiegħ: Il-kampjun ma ġiex ittrattat b'NaOH, iżda awtoklavat taħt l-istess kundizzjonijiet.Il-konverżjoni tal-massa ta '203.30/129.10 Da (f'mod MRM pożittiv) ġiet analizzata minn LC-MS.
Abbrevjazzjonijiet: BDDE, 1,4-butanediol diglycidyl ether;LC-MS, kromatografija likwida u spettrometrija tal-massa;MRM, monitoraġġ ta' reazzjoni multipla.
Fil-kampjuni kollha awtoklavi, bi jew mingħajr NaOH, il-konċentrazzjoni BDDE tnaqqset ħafna (sa 16.6 darbiet) (kampjuni 5-8, Tabella 2).It-tnaqqis fil-konċentrazzjoni tal-BDDE jista 'jkun dovut għall-fatt li f'temperaturi għoljin, l-ilma jista' jaġixxi bħala bażi (nukleofile) biex jiftaħ iċ-ċirku tal-epossidu tal-BDDE biex jifforma kompost 1,2-diol.Il-kwalità monoisotopika ta 'dan il-kompost hija differenti minn dik tal-BDDE u għalhekk mhux se tiġi affettwata.LC-MS skopra bidla tal-massa ta '203.30/129.10 Da.
Fl-aħħarnett, dawn l-esperimenti juru li l-ġenerazzjoni ta 'quċċati ġodda tiddependi fuq il-preżenza ta' BDDE, NAOH, u l-proċess ta 'awtoklavi, iżda m'għandha x'taqsam xejn ma' HA.
Il-quċċata l-ġdida misjuba f'ħin ta 'żamma ta' madwar 2.71 minuti kienet imbagħad ikkaratterizzata minn LC-MS.Għal dan il-għan, BDDE (9.9 mg/mL) ġie inkubat f'soluzzjoni akwea ta '1% NaOH u awtoklavat.Fit-Tabella 4, il-karatteristiċi tal-quċċata l-ġdida huma mqabbla mal-quċċata ta 'referenza tal-BDDE magħrufa (ħin ta' żamma ta 'madwar 3.47 minuti).Ibbażat fuq l-analiżi tal-frammentazzjoni tal-jone taż-żewġ qċaċet, jista 'jiġi konkluż li l-quċċata b'ħin ta' żamma ta '2.72 minuti turi l-istess frammenti bħall-quċċata BDDE, iżda b'intensitajiet differenti (Figura 6).Għall-quċċata li tikkorrispondi għall-ħin ta 'ritenzjoni (PIS) ta' 2.72 minuti, ġiet osservata quċċata aktar intensa wara frammentazzjoni f'massa ta '147 Da.Fil-konċentrazzjoni BDDE (9.9 mg/mL) użata f'din id-determinazzjoni, ġew osservati wkoll modi ta 'assorbiment differenti (UV, λ=200 nm) fl-ispettru ultravjola wara separazzjoni kromatografika (Figura 7).Il-quċċata b'ħin ta 'żamma ta' 2.71 minuti għadha viżibbli f'200 nm, filwaqt li l-quċċata BDDE ma tistax tiġi osservata fil-kromatogramma taħt l-istess kundizzjonijiet.
Tabella 4 Riżultati ta’ karatterizzazzjoni tal-quċċata l-ġdida b’ħin ta’ żamma ta’ madwar 2.71 minuti u l-quċċata tal-BDDE b’ħin ta’ żamma ta’ 3.47 minuti
Nota: Biex jinkisbu dawn ir-riżultati, saru analiżi LC-MS u HPLC (MRM u PIS) fuq iż-żewġ qċaċet.Għall-analiżi HPLC, tintuża skoperta UV b'wavelength ta' 200 nm.
Abbrevjazzjonijiet: BDDE, 1,4-butanediol diglycidyl ether;HPLC, kromatografija likwida ta 'prestazzjoni għolja;LC-MS, kromatografija likwida u spettrometrija tal-massa;MRM, monitoraġġ ta' reazzjoni multipla;m/z, proporzjon tal-massa għall-ħlas;PIS, prodott Ion scanning;dawl ultravjola, dawl ultravjola.
Nota: Il-frammenti tal-massa jinkisbu bl-analiżi LC-MS (PIS).Kromatogramma ta' fuq: spettru tal-massa ta' frammenti ta' kampjuni standard BDDE.Kromatogramma tal-qiegħ: L-ispettru tal-massa tal-quċċata l-ġdida misjuba (RRT assoċjat mal-quċċata BDDE hija 0.79).BDDE ġie pproċessat f'soluzzjoni ta '1% NaOH u awtoklavat.
Abbrevjazzjonijiet: BDDE, 1,4-butanediol diglycidyl ether;LC-MS, kromatografija likwida u spettrometrija tal-massa;MRM, monitoraġġ ta' reazzjoni multipla;PIS, prodott jone scan;RRT, ħin ta' żamma relattiv.
Figura 7 Kromatogramma tal-jone tal-jone prekursur 203.30 Da, u (A) il-quċċata l-ġdida b'ħin ta 'żamma ta' 2.71 minuti u (B) l-iskoperta tal-UV tal-quċċata standard ta 'referenza BDDE fi 3.46 minuti f'200 nm.
Fl-idroġels HA cross-linked kollha prodotti, ġie osservat li l-konċentrazzjoni residwa BDDE wara l-kwantifikazzjoni LC-MS kienet <2 ppm, iżda deher quċċata ġdida mhux magħrufa fl-analiżi.Din il-quċċata ġdida ma taqbilx mal-prodott standard BDDE.Il-prodott standard BDDE għadda wkoll mill-istess analiżi ta 'konverżjoni ta' kwalità (konverżjoni MRM 203.30/129.10 Da) fil-modalità MRM pożittiva.Ġeneralment, metodi analitiċi oħra bħall-kromatografija jintużaw bħala testijiet tal-limitu biex jinstabu BDDE fl-idroġels, iżda l-limitu massimu ta 'skoperta (LOD) huwa kemmxejn inqas minn 2 ppm.Min-naħa l-oħra, s'issa, NMR u MS intużaw biex jikkaratterizzaw il-grad ta 'cross-linking u/jew modifika ta' HA fil-frammenti ta 'unità taz-zokkor ta' prodotti HA cross-linked.L-iskop ta 'dawn it-tekniki qatt ma kien li jikkwantifika d-detezzjoni ta' BDDE residwu f'konċentrazzjonijiet baxxi bħal dawn kif niddeskrivu f'dan l-artikolu (LOD tal-metodu LC-MS tagħna = 10 ppb).
Ħin tal-post: 01-Settembru 2021